（中国器审 2024-02-28）
一、前言
生物素-亲和素（链霉亲和素）系统因其具有的特异性高亲和力和级联放大效应，已被广泛应用于临床检验领域当中。样本中高浓度生物素可能会对该检测系统产生干扰。日常的生物素摄入量通常不会产生干扰，但是近来随着高剂量生物素的摄入以及更高剂量生物素的治疗措施，生物素对体外诊断试剂的干扰以及对临床检验造成的风险引起人们广泛关注。由于高剂量生物素的摄入人群分布评估差异很大，因此引起的不良事件也多有报道。由于在一项药物临床实验中观察到因生物素干扰引起的检测结果不准确而导致严重不良事件，FDA先后出台了应对生物素干扰的警示信息及相应指南。IVD生产企业也采取不同的措施来降低生物素干扰的影响。以下从生物素-亲和素系统、生物素干扰机制、解决干扰的方法、对监管的思考等几个方面对该问题进行探讨。
二、生物素-亲和素系统
生物素（biotin），又称为维生素B7，维生素H，辅酶R，是一种水溶性维生素，分子量仅有244.31Da，在细胞中作为一种重要的辅酶，参与多条代谢途径，如糖代谢、脂肪酸合成、氨基酸代谢、糖原异生等。在体内生物素存在结合与游离两种形态，大约12%的生物素是共价结合，7%为可逆结合，其余80%左右为游离生物素。人体需要从外界摄入生物素来满足自身需求，通常通过膳食补充即可。生物素天然存在于多种食物（如蛋、肉、谷物、绿色蔬菜等）中，也可由肠道细菌合成。在复合维生素、孕期维生素以及促进头发、皮肤和指甲生长的营养品中也含有较高计量生物素。此外高剂量的生物素也可非处方用于糖尿病、脂代谢异常、生物素合成酶缺乏、羧化酶缺乏以及周围神经病变的医学用途。
图1. 生物素的结构
亲和素（avidin）是一种糖蛋白，分子量为67~68kd，每个分子由四个亚基组成，能够与4个生物素紧密结合。Neutravidin和链霉亲和素（streptavidin）类似，是去除糖基化的亲和素，分子量小于avidin，偏中性，其保留了对生物素的高亲和力，但是非特异结合特性降低。链霉亲和素从亲和素链霉菌（Streptomyces avidinii）中分离，因其更低的非特异性而得到广泛应用。
生物素-亲和素系统（Biotin-（Strept）Avidin System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素可与大多数蛋白、酶及其他分子的氨基共价结合形成偶联物，亲和素也可通过共价键连接到修饰的磁珠、固相载体等介质上，而1分子亲和素可与4分子生物素以非共价键的形式形成高亲和力的结合，并且可以耐受pH值的变化、去污剂、多次洗脱步骤、螯合剂以及其他极端反应条件（如温度）。生物素与亲和素之间的高亲和力与级联放大效应使BAS的免疫标记和有关的示踪分析更加灵敏，在不同检测系统在医学检验领域得到广泛应用。大约85%常见的化学发光分析仪采用了基于BAS的检测方法。
三、样本中的生物素对BAS检测系统的干扰
1. 生物素干扰的机制
生物素干扰是基于BAS的检测方法中普遍存在的问题。采用亲和素-生物素系统进行免疫检测时，如果待测样本中存在高浓度的游离生物素，将与生物素化抗体竞争结合亲和素的结合位点，若超过耐受的阈值，有可能影响检测结果。
生物素干扰生物素化免疫检测的机制因检测原理不同而不同。生物素的干扰在竞争法和夹心法中表现出相反的方向。当生物样本含有过量的生物素时，生物素会与生物素化抗体或抗原竞争结合到链霉亲和素包被的磁性表面，导致生物素化抗体或抗原的捕获减少。过量的生物素会在夹心免疫测定中产生错误的低结果，因为测定信号与分析物浓度成正比。在竞争性免疫测定中，过量的生物素会导致结果错误地升高，因为测定信号与分析物浓度成反比。竞争法通常用于小分子的检测，如睾酮，雌二醇、皮质醇、类固醇、T3（三碘甲状腺原氨酸）和T4、羟基维生素D等。已有多篇文献描述了生物素干扰的具体细节。
2. 生物素干扰依赖于几个因素：免疫检测试剂的组成及检测原理、患者服用生物素的剂量，样本中生物素的浓度，以及从最后一次服用生物素到样本采集的时间间隔等。
外源过量生物素不太会对不采用生物素和链霉亲和素系统的检测方法产生干扰，对于采用生物素-亲和素系统的检测试剂则需要充分评估生物素可能产生的干扰。
每日摄入的生物素在不同年龄与状态的人群中参考量不同。美国推荐的生物素摄入量不同人群有所不同，总体在5~35μg/d的范围。中国居民膳食生物素参考摄入量AI适宜摄入量）值为5~50 μg/d。
高剂量的摄入生物素有可能使人体样本中的生物素超过检测试剂的阈值从而干扰检测结果。以美甲、护肤、美发为目的生物素摄入可高达1250~2500μg/d，而多发性硬化症患者服用高达300mg/d的生物素，其他一些生物素缺乏的相关罕见病每日服用的生物素剂量也达到10~40mg。
血液中的生物素浓度及代谢动力学不同研究有不同结果。30 μg/日的生物素摄入量，正常循环浓度通常为 0.1 至 0.8 ng/mL。生物素在摄入后迅速吸收，并在 1 至 2 小时内达到血浆浓度峰值。口服 10 mg 剂量，相当于非处方药中的一些最高剂量，导致血浆峰浓度范围为 55 至 140 ng/mL (225~573 nmol/L)。而口服剂量100mg 导致血浆峰浓度范围为 375 至 450 ng/mL (1535~1842 nmol/L)。多发性硬化症患者口服生物素300mg/d，可导致血浆/血清生物素水平大于1000ng/mL。当每日摄入500mg生物素，会导致血液中的生物素浓度非常高，从而干扰检测结果。
不同试剂受到生物素干扰的程度也不同，生物素干扰水平从31.35 ~1000 ng/mL（ 0.13~4.09 μM）不等。
生物素积累效应也确实存在。研究结果显示，每天连续给药到第 7 天的循环浓度是 第 1 天同一时间点的两倍。研究数据表明持续摄入生物素 3 天后可达到稳态浓度。
此外摄入的生物素浓度不同，血液中的清除半衰期也不同，血浆生物素的半衰期为110分钟，理论上5.5个半衰期（大约9小时）可以从血循环中清除。低浓度的生物素从健康个体的循环中迅速清除，消除半衰期约为 2 小时，而高剂量实验表明半衰期长达 18.8 小时。一项针对表观健康个体的药代动力学研究表明，口服生物素剂量为1、5、10、100 和 300 毫克的生物素之后，分别在1、5.5、20、108 和 146 小时后，血液浓度预计会降至 20 ng/mL (81.9 nmol/L) 以下。但是生物素的清除还受到肾功能的影响。文献报道中血浆的中生物素浓度仅是游离生物素，而实际上生物素与蛋白存在着可逆的结合。
目前没有充分证据来明确服用生物素后多长时间再检测会消除生物素干扰对检测结果的影响。
越来越多的文献表明在促甲状腺激素 (TSH) 、甲状腺素等甲状腺功能检测、甲状旁腺激素 (PTH)、促肾上腺皮质激素、催乳素、睾酮、皮质醇等内分泌检测、肿瘤标志物、心脏功能性标志物等检测中均不同程度收到生物素的干扰。在许多此类案例研究中，当患者停止服用生物素时，受影响的实验室结果发生显著变化证实了生物素干扰的存在。
四、降低生物素干扰的方法
1. 系列稀释样本再进行检测。
2. 换一个对生物素不敏感的检测方法进行检测，如液相质谱法等，而质谱法通常需要送到参考实验室进行检测。
3. 待生物素在体内清除后再重复检测，但是该方法现实中不易执行，患者通常意识不到生物素可能会产生干扰。所需的时间与服用的生物素剂量，肾功能等多种因素有关, 短则2小时可清除低剂量的生物素，长则可需15天（如甲状腺功能检测试剂）甚至数月才能清除。对于多发性硬化症或其他生物素缺乏相关疾病的人群来说延长时间重新检测不太适用。
4. 清除游离生物素后再进行检测。样本中的生物素可以通过包被有亲和素/链霉亲和素的固相介质上（如磁珠、琼脂微珠、硅化微珠等），与样本混合孵育后去除亲和素-亲和素复合物。结合链霉亲和素的多聚物可以预装到小的注射器中，方便加载含生物素的样本。需要注意的是清除方案需要全面评估后才能应用。尽管经过生物素清除后的检测结果不能报告，但是可以提醒干扰的存在，让患者避免摄入生物素后一定时间再次取样进行检测。罗氏开发了专利抗体清除游离生物素减少样本中的游离生物素。
5. 通过临床一致性进行验证。
对于企业而言，开发不受生物素干扰的体系需要改变试剂的组成、进行充分的性能验证、并且获得监管机构的批准。
对于医疗结构与患者，均应当意识到样本中高剂量的生物素可能产生干扰，从而避免误诊或者采取错误的治疗措施。
须注意的是生物素仅仅是可能产生干扰的一个因素之一。对于检测结果的干扰，可能是由多个影响因素共同起作用，例如嗜异性抗体(如HAMA，HAAA)等，其他常见内源性干扰物质（如溶血、高血脂、高胆红素等）等。因此需要更全面的进行分析，结合临床表型以及其他验证方法对结果进行综合判断。
五、监管思考
对于以生物素-亲和素系统为基本原理的IVD试剂，样本中生物素对检测系统的干扰性是在产品设计开发中就需要考虑的问题。对于生物素干扰性的研究，EP37(2018年)文件中显示生物素的最高药物浓度为1.17E-01mg/dL (1.17ng/mL), 建议的检测浓度为3.51ng/mL。按照FDA的推荐剂量摄入30μg/d生物素通常不会对3.51ng/mL的阈值的产品产生生物素干扰。但是随着生物素摄入量的增加以及不良反应的不断报道，FDA先后发布警示信以及相关指南对生物素干扰进行监管，将需要研究的生物素最高浓度设定到3500ng/mL。
部分企业已经在陆续按照指南要求对各自的相关产品进行生物素干扰评估，并采取不同的措施提高产品抗生物素干扰性能，使其能够耐受高浓度的生物素干扰，如在说明书增加警示信息注明相关风险，或者优化产品设计、优化检测流程等。对于此类变更注册的申请，需要综合考虑产品发生的具体变化及其对产品性能的影响，通过充分的性能验证保证变更后产品的安全有效。
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审评六部 王佩荣 供稿
（转载自国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心网站）